Le Musée a été initialement créé en tant que Pinacothèque dans les années 1920, mais en réalité, la formation de la riche collection artistique, qui peut également être reconstruite d'un point de vue documentaire, a commencé plusieurs siècles auparavant. En effet, le gouvernement municipal a toujours été impliqué dans l'enrichissement des collections artistiques, en commandant des œuvres à des artistes prestigieux dès le XVIe siècle, pour orner et rendre plus important le Palazzo Comunale. Le point de départ a été bien sûr offert par la Résurrection de Piero della Francesca, emblème et symbole de la ville, peinte vers 1460 dans la salle des Conservateurs du Palazzo della Residenza, œuvre définie par l'écrivain anglais Aldous Huxley comme "la plus belle peinture du monde". Grâce à ce précédent illustre, l'appareil gouvernemental a déclenché un premier et innovant phénomène de collection ouvert au public. Déjà dans la seconde moitié du XVIe siècle, afin de rendre plus explicite le caractère représentatif du Palazzo, la Municipalité a appelé les Bassano à décorer la Chapelle de la Résidence, célèbres peintres vénitiens très actifs à Sansepolcro, et a acquis des œuvres de Raffaellino del Colle et Leonardo Cungi.

Au cours du XVIIe siècle, lors d'une visite de Léopold II, la collection primitive a été enrichie par le transfert, depuis le proche Palazzo Pretorio, des célèbres gravures de Cherubino Alberti. Fort de ces illustres précédents, il était alors naturel d'inclure dans ces salles, en 1846, le San Ludovico, détaché des murs du Palazzo Pretorio. Suite aux suppressions léopoldines et napoléoniennes des ordres religieux, entre la fin du XVIIIe siècle et le premier décennie du XIXe siècle, la collection du Musée s'est constituée comme une galerie expérimentale et approximative d'œuvres d'art. La volonté croissante de préserver et protéger le patrimoine artistique de la ville a soutenu le transfert dans les salles du Palazzo della Residenza d'œuvres qui couraient "le risque de dégradation"; on faisait référence en particulier aux peintures conservées dans l'église de Santa Chiara, de Sant'Agostino et au polyptyque de la Madonna della Misericordia entré dans la Pinacothèque Civique en 1901. Au nouveau siècle, une véritable culture de la conservation s'est répandue à Sansepolcro, au point que l'organisation de la Pinacothèque impliquait également des experts qui, parallèlement à la renommée littéraire de Piero (Roberto Longhi, Mario Salmi, Kenneth Clark et Rudolf Wittkower), manifestaient un intérêt croissant pour la Valtiberina. Au fil des ans, l'enthousiasme général a été renforcé par la découverte, et le transfert ultérieur dans les salles du Musée, du San Giuliano. Par la suite, la collaboration entre la Municipalité de Sansepolcro, la Surintendance d'Arezzo et la Région Toscane a permis d'inaugurer, en 1975, le nouveau Musée qui s'est agrandi dans ses espaces d'exposition grâce à la récupération de locaux au dernier étage et au sous-sol.