El Museo fue establecido inicialmente como Pinacoteca en la década de los años veinte del siglo XX, pero en realidad, la formación de la rica colección artística, que también puede ser reconstruida desde un punto de vista documental, comienza muchos siglos antes. De hecho, el gobierno de la ciudad siempre estuvo involucrado en el enriquecimiento de las colecciones artísticas, encargando obras a prestigiosos artistas ya desde el siglo XVI, para embellecer y hacer más importante el Palazzo Comunale. El punto de partida fue, obviamente, la Resurrezione de Piero della Francesca, emblema y símbolo de la ciudad, fresco alrededor de 1460 en la sala de los Conservadores del Palazzo della Residenza, obra definida por el escritor inglés Aldous Huxley como "la pintura más bella del mundo". Gracias a este ilustre precedente, el gobierno inició un primer e innovador fenómeno de coleccionismo abierto al público. Ya en la segunda mitad del siglo XVI, con el fin de hacer más explicativo el carácter representativo del Palazzo, el Municipio llamó a decorar la Capilla de la Residenza a los Bassano, famosos pintores venecianos muy activos en Sansepolcro, y adquirió obras de Raffaellino del Colle y Leonardo Cungi.

Durante el siglo XVII, con motivo de una visita de Leopoldo II, la primitiva colección fue incrementada gracias al traslado, desde el cercano Palazzo Pretorio, de las famosas grabados de Cherubino Alberti. Dados estos ilustres antecedentes, fue natural luego incluir en estas salas, en 1846, el San Ludovico, desprendido de las paredes del Palazzo Pretorio. Tras las supresiones leopoldinas y napoleónicas de las órdenes religiosas, entre finales del 1700 y la primera década del 1800, la colección del Museo se fue constituyendo como una experimental y aproximativa galería de obras de arte. La creciente voluntad de conservar y proteger el patrimonio artístico ciudadano apoyó el traslado a las salas del Palazzo della Residenza de obras que corrían "el peligro de deterioro"; se referían en particular a las pinturas conservadas en la iglesia de Santa Chiara, de Sant'Agostino y al políptico de la Madonna della Misericordia que pasó a formar parte de la Pinacoteca Civica en 1901. En el nuevo siglo en Sansepolcro se difundió una verdadera cultura de la conservación, tanto es así que la organización de la Pinacoteca involucraba también a expertos que, al mismo tiempo que la fortuna literaria de Piero (Roberto Longhi, Mario Salmi, Kenneth Clark y Rudolf Wittkower), demostraban un creciente interés por la Valtiberina. Con el paso de los años, el entusiasmo general fue respaldado por el descubrimiento, y el posterior traslado a las salas del Museo, del San Giuliano. Posteriormente, la colaboración entre el Comune di Sansepolcro, la Soprintendenza di Arezzo y la Regione Toscana permitió inaugurar, en 1975, el nuevo Museo que se amplió en sus espacios expositivos gracias a la recuperación de ambientes en el último piso y en el sótano.