Le tableau représente Judith en train de couper la tête du général assyrien Holopherne qui assiégeait la ville de Betula. L'héroïne juive, assistée de l'esclave Abra, qui participe activement à la décapitation, incarne la chasteté et la force morale. Par rapport à la plupart des peintres des XVIe et XVIIe siècles, qui ont choisi pour la représentation de cet épisode biblique le moment de la fuite des deux femmes du camp ennemi après l'assassinat, ou Judith qui montre triomphalement la tête d'Holopherne, Gentileschi a choisi le moment le plus dramatique, à savoir celui de la décapitation, en s'inspirant de la célèbre toile du même sujet du Caravage aujourd'hui au Palazzo Barberini. La peinture était également liée au traumatisme subi par le peintre, qui en 1611 a été violée par son collègue, Agostino Tassi. Il s'agit d'une œuvre ancienne, exécutée à Rome entre 1612 et 1613, comme en témoigne la forte empreinte naturaliste qui s'accompagne de quelques incertitudes dans la composition et l'anatomie. La version conservée aux Offices est considérée par les experts comme postérieure à celle-ci. La position rigide du bras de Judith trouve une référence directe dans la peinture homonyme du Caravage, tandis que la figure d'Holopherne dénote la connaissance de l'œuvre avec un sujet analogue de Rubens, ainsi que celle représentant David et Goliath de son père, Orazio Gentileschi . Quelques copies de la peinture et une version plus petite sur tableau noir conservée au palais de l'archevêque de Milan sont connues.