La pintura representa a Judit en el acto de cortar la cabeza del general asirio Holofernes que estaba sitiando la ciudad de Betula. La heroína judía, asistida por el esclavo Abra, que participa activamente en la decapitación, encarna la castidad y la fuerza moral. Frente a la mayoría de los pintores de los siglos XVI y XVII, que eligieron para la representación de este episodio bíblico el momento de la huida de las dos mujeres del campo enemigo tras el magnicidio, o Judit que muestra triunfante la cabeza de Holofernes, Gentileschi eligió el momento más dramático, a saber, el de la decapitación, inspirándose en el famoso lienzo con el mismo tema de Caravaggio ahora en el Palacio Barberini. El cuadro también estaba relacionado con el trauma sufrido por la pintora, quien en 1611 fue violada por su colega, Agostino Tassi. Se trata de una obra temprana, realizada en Roma entre 1612 y 1613, como lo demuestra la fuerte impronta naturalista que va acompañada de algunas incertidumbres en la composición y la anatomía. Los expertos consideran que la versión conservada en los Uffizi es posterior a esta. La posición rígida del brazo de Judith encuentra una referencia directa en el cuadro homónimo de Caravaggio, mientras que la figura de Holofernes denota el conocimiento de la obra con un tema análogo de Rubens, así como la que representa a David y Goliat de su padre, Orazio Gentileschi. . Se conocen algunas copias de la pintura y una versión más pequeña en pizarra conservada en el Palacio Arzobispal de Milán.