Das Gemälde zeigt Judith beim Abschlagen des Kopfes des assyrischen Generals Holofernes, der die Stadt Betula belagerte. Die jüdische Heldin, assistiert von der Sklavin Abra, die aktiv an der Enthauptung teilnimmt, verkörpert Keuschheit und moralische Stärke. Im Vergleich zu den meisten Malern des 16. und 17. Jahrhunderts, die für die Darstellung dieser biblischen Episode den Moment der Flucht der beiden Frauen aus dem feindlichen Lager nach dem Attentat wählten, oder Judith, die triumphierend den Kopf des Holofernes, Gentileschi, zeigt wählte den dramatischsten Moment, nämlich den der Enthauptung, inspiriert von dem berühmten Gemälde mit dem gleichen Thema von Caravaggio, das sich jetzt im Palazzo Barberini befindet. Das Gemälde stand auch im Zusammenhang mit dem Trauma der Malerin, die 1611 von ihrem Kollegen Agostino Tassi vergewaltigt wurde. Es handelt sich um ein frühes Werk, das zwischen 1612 und 1613 in Rom aufgeführt wurde, was durch die starke naturalistische Prägung belegt wird, die von einigen Unsicherheiten in der Komposition und Anatomie begleitet wird. Die in den Uffizien aufbewahrte Version wird von Experten als später angesehen. Die starre Armhaltung der Judith findet eine direkte Referenz im gleichnamigen Gemälde von Caravaggio, während die Figur des Holofernes auf die Kenntnis des Werks mit analogem Sujet von Rubens sowie der Darstellung von David und Goliath seines Vaters Orazio Gentileschi hinweist . Einige Kopien des Gemäldes und eine kleinere Version auf Tafel, die im erzbischöflichen Palast in Mailand aufbewahrt werden, sind bekannt.