L’opera è realizzata tra il 1594 e il 1595 dal pittore Federico Barocci. La tela gli viene commissionata dall’ultimo Duca di Urbino, Francesco Maria II Della Rovere, per la Chiesa urbinate del Convento dei Cappuccini. Nel quadro San Francesco che riceve le stigmate, si raffigura il momento in cui San Francesco e Fra’ Leone, dopo essersi ritirati in preghiera sul monte La Verna, nel buio della notte vengono improvvisamente abbagliati dalla luce fiammeggiante emanata da Cristo crocifisso nelle sembianze di un Serafino (angelo con sei ali). La luce inonda principalmente il Santo, rappresentato a braccia aperte mentre riceve le ferite sulle mani, sui piedi e sul costato. Fra’ Leone è seduto a terra sulla sinistra, raffigurato nel gesto di ripararsi il volto dalla violenza della luce. Sul fondo emerge la facciata della Chiesa dei Cappuccini di Urbino, che fa da scenario all’episodio biblico dell’uccisione di Abele da parte di Caino di fronte ad un falò. Il soggetto era già stato affrontato dal Barocci, in altre opere, ma nel dipinto di Urbino il pittore è capace di dilatare maggiormente lo spazio e di dare alla scena un più intenso respiro e una più alta incisività. Ambientando il soggetto nelle ore notturne, Barocci conferisce alla scena un’intensa emotività e realizza uno tra i notturni più suggestivi della pittura italiana.